HARVARD – A EXPOSIÇÃO AO ABUSO NA INFÂNCIA ESTÁ ASSOCIADA À METILAÇÃO DO DNA DO ESPERMA HUMANO

https://www.nature.com/articles/s41398-018-0252-1

Filhos de pessoas expostas a abuso na infância correm maior risco de desenvolver disparidades de neurodesenvolvimento e de saúde física ao longo da vida. Experimentos em animais indicaram que estressores ambientais paternos podem afetar a metilação do DNA do esperma e a expressão gênica em uma prole. O abuso na infância tem sido associado a marcas epigenéticas no sangue, saliva e tecido cerebral humano, com diferenças de metilação estatisticamente significativas que variam amplamente. No entanto, nenhum estudo examinou a associação de abuso infantil com metilação do DNA em gametas. Nós examinamos a associação do abuso infantil com a metilação do DNA no esperma humano. Combinado abuso físico, emocional e sexual na infância foi caracterizado como nenhum, médio ou alto. A metilação do DNA foi testada em 46 amostras de esperma de 34 homens em uma coorte longitudinal não-clínica usando o HumanMetilation450 BeadChips. Realizamos a análise de componentes principais e examinamos a correlação dos componentes principais com a exposição ao abuso. O abuso na infância foi associado a um componente que capturou 6,2% da variância total na metilação do DNA (p  <0,05). Em seguida, investigamos as regiões diferencialmente metiladas por exposição a abuso. Identificamos 12 regiões de DNA diferencialmente metiladas por abuso infantil, contendo 64 sondas e incluindo sítios em genes associados à função neuronal ( MAPT , CLU ), regulação de células gordurosas ( PRDM16 ) e função imunológica ( SDK1). Examinamos comportamentos de saúde na idade adulta, saúde mental e exposição ao trauma como mediadores potenciais de uma associação entre abuso e DNAm, e descobrimos que a saúde mental e a exposição ao trauma mediam em parte a associação. Finalmente, construímos um marcador epigenético parcimonioso para abuso infantil usando uma abordagem de aprendizado de máquina, que identificou três sondas que previam abuso infantil versus abuso infantil em 71% dos participantes. Nossos resultados sugerem que o abuso na infância está associado à metilação do DNA do esperma, o que pode ter implicações no desenvolvimento da prole. Amostras maiores são necessárias para identificar com maior confiança regiões genômicas específicas diferencialmente metiladas por abuso infantil. Introdução
O abuso na infância está associado a maus-tratos na saúde mental e física da vítima ao longo da vida 1 , 2 , 3 . O abuso na infância também tem sido associado à função alterada de múltiplos sistemas biológicos 4 , 5 , 6 , 7 , com diferenças persistindo até a idade adulta 8 , 9 . Mudanças nas marcas epigenéticas têm sido propostas como um mecanismo pelo qual o abuso na infância aumenta o risco de doenças neuropsiquiátricas e cardiometabólicas 10 , 11 . Diferenças nas marcas epigenéticas foram encontradas na metilação do DNA (DNAm) do sangue 12 , 13, saliva 14 e tecido cerebral 15 por experiência de abuso na infância 16 . A associação de abuso infantil com DNAm em gametas é de particular interesse, tanto porque os padrões de DNAm nos gametas têm sido associados com a fertilidade 17 , 18 como a possibilidade de que o DNAm dos gametas possa afetar o desenvolvimento saudável da prole 19 , 20 .

Em modelos animais, demonstrou-se que uma variedade de exposições afetam o DNAm do esperma, incluindo o estado nutricional 21 , os hormônios de desregulação endócrina 22 e outros poluentes 23 . Experimentos em animais também indicaram que estressores paternos podem afetar DNAm 24 , expressão gênica 25 , 26 e comportamento 24 , 27 na prole. Em camundongos, a exposição à instabilidade social no início da vida leva à ansiedade e a interações sociais defeituosas, comportamentos que são transmitidos a três gerações de filhos por meio da linhagem paterna 28 . A transmissão de experiências paternas de trauma psicológico através de gametas também foi documentada26 e corresponde a alterações no DNA do espermatozoide paterno 24 .

Até onde sabemos, nenhum estudo em humanos examinou os efeitos dos estressores psicossociais no DNAm do esperma; no entanto, o estresse psicológico em humanos tem sido associado à pior qualidade do sêmen, incluindo menor concentração de espermatozóides móveis, menor porcentagem de espermatozoides progressivamente móveis e redução do deslocamento lateral da cabeça 29 , 30 . Evidências sugerem que exposições ambientais como fumaça de cigarro 31 e indicadores de estado de saúde, como idade 32 e obesidade 33 , 34 , estão associados à epigenética espermática em humanos. Além disso, relevante para o abuso na infância, o período pré-puberal foi identificado como uma janela potencial de sensibilidade do epigenoma do esperma a influências ambientais35 . Assim, é possível que estressores psicossociais, incluindo abuso infantil, afetem o epigenoma do esperma humano, incluindo o DNAm.

No presente estudo, avaliamos as diferenças no genoma de espermatozóides em todo o genoma em associação com abuso infantil em uma coorte longitudinal não-clínica de homens. Calculamos os componentes principais (PCs) dos valores de metilação para todas as sondas e examinamos a associação de abuso infantil com PCs. Os locais de DNAm normalmente funcionam em conjunto com os locais vizinhos para afetar a expressão gênica 36Assim, pode ser mais significativo investigar DNAm dentro de regiões genômicas, em oposição a locais individuais. Portanto, examinamos regiões diferencialmente metiladas (DMRs) para associação com abuso infantil. Finalmente, usamos métodos de aprendizado de máquina para identificar sites preditivos de abuso infantil em todos os locais e construir um preditor parcimonioso do status de abuso infantil. Como abuso na infância tem sido associado com maior prevalência de comportamentos de risco para a saúde na idade adulta 37 , 38 , transtornos mentais 39 , 40 e exposição ao trauma 41 , 42, realizamos análises exploratórias para examinar se o índice de massa corporal (IMC), tabagismo, sintomas depressivos, sintomas de estresse pós-traumático e exposição ao trauma foram responsáveis ​​por uma possível associação do abuso infantil com o DNAm do esperma.

MATERIAIS E MÉTODOS
Amostra
O Growing Up Today Study (GUTS) é uma coorte longitudinal norte-americana de 16.882 filhos de mulheres participantes do Nurses ‘Health Study II, matriculados em 1996, com idades entre 9 e 14 anos, e acompanhados anualmente ou bienalmente .. Em 2010, foi perguntado aos participantes do sexo masculino se estariam dispostos a doar uma amostra de sêmen. Quase dois terços (64%) estavam dispostos. Idade, IMC e raça não diferiram entre homens dispostos e dispostos a doar. Em 2012, contatamos 66 homens para solicitar uma amostra; 54 homens (82%) retornaram a amostra pelo correio. Convidamos ainda os primeiros 28 homens que devolveram a amostra a enviarem uma segunda; 24 homens (86%) retornaram a segunda amostra. Pediu-se aos homens que se abstivessem da ejaculação por pelo menos 48 horas antes de produzir a amostra por masturbação em um recipiente de coleta (Thermo Scientific Nalgene Jars). As amostras foram enviadas durante a noite, com quatro pacotes de refrigerante em gel ao redor da amostra, para o Centro de Fertilidade do Hospital Geral de Massachusetts, onde a concentração ea morfologia espermática foram medidas. O sêmen remanescente foi aliquotado e congelado em nitrogênio líquido. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. O Conselho de Revisão Institucional da Partners Healthcare aprovou este estudo.

Realizamos ensaios de DNAm em 48 amostras de 34 homens. Destes, 20 homens contribuíram com amostras únicas, 12 homens contribuíram com duas amostras cada, produziram ~ 3 meses de intervalo, e duas amostras de homens foram analisadas duas vezes como réplicas técnicas, para um total de 48 amostras analisadas. Nós oversampled homens que foram expostos a altos níveis de abuso, de tal forma que as amostras que foram analisadas incluíram 17 homens expostos ao alto, 5 homens para médio e 12 homens para nenhum abuso de infância.

Medidas
Experiências de abuso físico, emocional e sexual antes dos 18 anos foram medidas em 2007, quando os participantes tinham entre 18 e 23 anos. O abuso físico e emocional foi medido com quatro itens do Childhood Trauma Questionnaire (CTQ), questionando a frequência com que um adulto da família gritava, insultava, punia com crueldade e batia com tanta força que deixava hematomas 44 . As respostas ao CTQ foram somadas 44e depois divididos em quartis com base na sua distribuição em toda a coorte (quartil mais baixo = 0 pontos, quartil mais alto = 3 pontos). O abuso físico e emocional também foi medido com três itens das Escalas de Táticas de Conflito (CTS), questionando a frequência que um adulto da família empurrou; ameaçou socar, chutar ou bater com alguma coisa; na verdade socou, chutou ou bateu com alguma coisa; ou fisicamente atacado 45 . As opções de resposta para o CTQ e o CTS variaram de “nunca” a “muito frequentemente”. As respostas ao CTS foram distorcidas, com a maioria dos entrevistados relatando nenhuma dessas experiências. Portanto, dividimos essa escala em 0: menor 50%, 1: próximo 25% e 2: maior 25%.

O abuso sexual foi questionado em cada período de tempo com duas perguntas sobre experiências sexuais indesejadas com um adulto ou uma criança mais velha (por exemplo, “um adulto ou uma criança mais velha forçaram você a qualquer atividade sexual ameaçando você ou machucando você de alguma forma?”) 45 . Opções de resposta incluídas: não; uma vez; ou> uma vez.

Para oversample homens expostos a altos níveis de abuso, criamos uma medida geral de abuso infantil em três níveis: nenhum, moderado e alto. Homens com “sem abuso” ( N  = 12) estavam na categoria mais baixa de ambas as medidas de abuso físico e emocional e não tinham sofrido abuso sexual. Entrevistados com “alto abuso” ( N = 17) ou estavam no nível mais alto do CTS ou no nível mais alto do CTQ, ou tinham uma mistura de respostas elevadas em ambos os questionários. Todos ou quase todos os homens deste grupo sofreram punições que pareciam cruéis, gritavam e gritavam e lhes diziam coisas ofensivas e insultantes. Todos haviam sido empurrados, agarrados, agredidos ou fisicamente atacados de alguma outra forma, e a maioria também havia sido ameaçada pela violência. Dois homens nesse grupo foram abusados ​​sexualmente. Cinco participantes ficaram entre os grupos “sem abuso” e “alto abuso” e foram considerados como tendo sofrido abuso “médio”. Também resumimos as medidas de CTQ, CTS e abuso sexual para criar uma medida contínua de gravidade do abuso (variação de 0 a 7) e participantes dicotomizados como nenhum a médio (0-2) versus abuso elevado 3 , 4, 5 , 6 , 7 .

Covariáveis
Examinamos as características da amostra de sêmen, incluindo volume de ejaculado, concentração espermática, porcentagem de morfologia normal, data de coleta, tempo de coleta e intervalo de abstinência, bem como características do participante, incluindo idade de coleta, mês de nascimento e etnia como possíveis covariáveis. Além disso, incluímos informações relatadas pelas mães dos participantes, membros da coorte do Nurses ‘Health Study II, sobre sua ascendência, a condição socioeconômica da infância, um índice de renda familiar, posição social materna e educação paterna, relatada em 1999 – 2001.

Mediadores hipotéticos
O abuso na infância aumenta o risco de comportamentos de risco para a saúde na idade adulta, transtornos mentais 46 , 47 e exposição ao trauma 42 , fatores que podem explicar uma associação de abuso na infância com DNAm de esperma na idade adulta. Examinamos tabagismo, IMC (por autorrelato em 2010 e 2007), sintomas depressivos (medidos com o Center for Epidemiologic Studies Depression Scale-10 48 em 2010), sintomas de estresse pós-traumático (medidos com a Escala de Triagem Abreviada de 7 itens para DSM -PTSD 49 em 2007) e exposição ao trauma (medida em 2007 com 13 itens adaptados do Brief Trauma Questionnaire 50 , por exemplo, agressão física, violência por parceiro íntimo e doença grave) como mediadores potenciais.

Ensaio DNAm
Um método de lise diferencial envolvendo uma série de seis lavagens foi realizado para separar espermatozoides das células epiteliais e redondas ( Material Suplementar ). Em seguida, realizamos ensaios de DNAm com BeadChips (Illumina) Infinium HumanMetilation450 (450 K) usando DNA tratado com bissulfito (kit EZ-96 DNA Methylation, Zymo Research, Irvine, CA). Estes ensaios produzem 485 577 pontos de dados, abrangendo 482 421 locais CpG e 3091 locais CpN. Os escores de intensidade bruta foram cor corrigidos e o fundo foi subtraído usando GenomeStudio Software (Illumina). O valor de β de metilação para cada sonda representa uma relação contínua entre 0 (0% metilado) e 1 (100%). As sondas foram excluídas da análise posterior se tivessem um valor de detecção p <0,01 ( n = 2144 sondas) ou se> 5% das amostras não tinham um valor β ( n  = 12.353 sondas). Sondas que se ligaram in silico ao cromossomo X e Y além dos alvos especificados foram excluídas 51 , deixando N  = 439.746 sondas disponíveis para análise posterior. A normalização inter-amostras foi realizada por meio da normalização quantílica 52 . Para contabilizar os dois tipos de sondas no Illumina BeadChip, a normalização foi realizada usando o quanteto de subconjunto dentro da normalização de matriz (SWAN) 53. Para determinar se havia efeitos em lote, o PCA foi realizado nos dados normalizados, seguido pelas correlações de Spearman dos PCs com todas as variáveis ​​técnicas. Um pequeno efeito de lote associado ao número e à posição do chip foi removido usando métodos Bayes empíricos (pacote R SVA, função ComBat, Figura Suplementar S1 ) 54 .

Para avaliar a pureza das nossas amostras de esperma foram lavados, foram comparados DNAM na nossa amostra com DNAM a partir de um estudo independente de amostras contaminadas e purificados de esperma (Gene Expression Omnibus (GEO) 55 GSE108058, Suplementar Figura S2 ). Nós mesclamos o conjunto de dados GEO com nossos próprios dados e executamos o PCA. A grande maioria da variação na metilação está associada à heterogeneidade do tecido, portanto os primeiros PCs devem estar correlacionados com a pureza das amostras de sêmen. Plotando o PC1 contra o PC2 (para fins de visualização), nossas amostras se agruparam com o sêmen puro, fornecendo evidências de que havíamos purificado com sucesso nossas amostras. Além disso, examinamos o status de metilação de duas regiões de controle de imprinting ( HYMAI e GNAS-AS). Essas regiões são paternalmente expressas e, portanto, anteciparíamos que essas regiões seriam totalmente não metiladas se nossas amostras contivessem gametas haploides purificados (em oposição a hemi-metilados em tecido somático). Calculamos o valor médio de DNAm β para cada sonda subjacente a essas regiões (130 sondas) para cada amostra em nosso estudo. A grande maioria das amostras apresentou mediana β  <0,05, sugerindo boa pureza (Tabela Suplementar S1 , Figura Suplementar S3 ). Análises
Para caracterizar a amostra do estudo, comparamos a idade, a raça e a exposição ao abuso dos participantes do estudo com todos os homens com STV. Em seguida, para os participantes do estudo, calculamos a prevalência para variáveis ​​categóricas e média para variáveis ​​contínuas para covariáveis ​​por estado de abuso infantil.

Análise de componentes principais

Para investigar se o abuso na infância e nossas covariáveis ​​estavam associadas à variação no DNAm, nós conduzimos PCA com todas as sondas ( N = 439.746) utilizando uma amostra seleccionada aleatoriamente por sujeito. O PCA reduz a dimensionalidade dos dados, identificando os componentes ortogonais dos valores de metilação de todas as sondas individuais, com PC1 explicando a maior variância. Examinamos a associação das variáveis ​​de abuso infantil contínuo e categórico e as covariáveis ​​com PCs centrados, usando ANOVAs unidirecionais para variáveis ​​ordinais e categóricas e as correlações de Spearman para variáveis ​​contínuas. Para os PCs que foram estatisticamente significativamente associados ao abuso na infância, investigamos quais sondas específicas contribuíram mais para o PC, primeiro identificando sondas individuais com a maior pontuação de PC (o 1% de sondas com as maiores pontuações positivas e 1% com as maiores pontuações negativas ) e, em seguida, aumentar a probabilidade de relevância biológica,β  ≥ 5%, ondeΔ β= β¯ ¯alto abuso -β¯ ¯sem abuso . Valores de P não foram ajustados para múltiplos testes, pois esta foi uma análise exploratória para determinar associações com DNAm.

Análise DMRs
Em seguida, investigamos se o abuso na infância estava associado a padrões de DNAm em sondas espacialmente agrupadas. Investigamos DMRs por exposição a abuso infantil usando o pacote R DMRcate 56 (Bioconductor, http://www.bioconductor.org), usando a mesma amostra selecionada aleatoriamente por sujeito usado no PCA. DMRcate primeiro avalia a associação da exposição (abuso infantil) com a metilação em cada local CpG, em seguida, agrupa as sondas em DMRs com base na similaridade do tamanho do efeito e direcionalidade com distâncias de ≤ 1000 pb entre eles. Os DMRs são então corrigidos para vários testes, calculando a taxa de descoberta falsa (FDR) para cada DMR. DMRs que não atendem um FDR ≤ 0,05 e uma alteração de dobra ≥ 0,05 são descartados. Consideramos regiões como DMRs se fossem estatisticamente significantes em um FDR ≤ 0,05, continham ≥ 3 sondas e tivessem uma diferença no DNAm β (Δ β ) ≥ 5%, onde Δ β  = β¯ ¯alto abuso -β¯ ¯sem abuso . Conduzimos essas análises com a variável de abuso infantil ordinal para reduzir os efeitos de outliers, depois verificamos que os resultados foram semelhantes em análises usando a variável abuso contínuo na infância. Verificamos nossos achados ao substituir a amostra usada nas análises primárias pela amostra replicada de cada homem que contribuiu com duas amostras ( N  = 12) e re-executar as análises de DMR usando amostras originais de 22 homens e replicar amostras de 12 homens. Finalmente, em locais localizados em DMRs identificados, calculamos o coeficiente de correlação intraclasse (ICC) entre a primeira e a segunda amostra nos valores de DNAm β .

Para examinar a concordância de nossos dois métodos de identificação de sondas diferencialmente metiladas por abuso infantil, comparamos a sobreposição em sondas identificadas usando PCA e sondas identificadas na análise de DMR.

Análise de aprendizado de máquina
Finalmente, usamos o aprendizado de máquina para identificar os locais preditivos de abuso na infância e: (1) compará-los com os locais identificados na análise da DMR e (2) construir um preditor parcimonioso do status de abuso infantil. Nós ajustamos uma regressão linear penalizada (“rede elástica”) para selecionar sondas informativas do conjunto de todas as sondas usando a variável de abuso infantil dicotomizado (nenhum / abuso médio / alto, parâmetro de mistura α definido como 0,5, o padrão). A regressão penalizada começa ajustando um modelo linear único incluindo todas as sondas, em seguida, seleciona um subconjunto de sondas relevantes, reduzindo os coeficientes lineares e configurando para coeficientes zero abaixo de um determinado limiar .. As sondas selecionadas são aquelas com coeficientes não zero. Nós estimamos o parâmetro de penalidade λ com a validação cruzada de dez vezes e o definimos como 0,095. Aplicamos o preditor resultante a três conjuntos de dados independentes (Gene Expression Omnibus 55 GSE108058, GSE102970 58 e GSE64096 59 ) para verificar se a prevalência de abuso estimada com este preditor foi aproximadamente a mesma que a prevalência em toda a coorte do GUTS (alta prevalência de abuso = 28,8%). Como não foram disponibilizados conjuntos de dados de DNAm de esperma com o abuso na infância medido, não foi possível testar sua capacidade de prever o status de abuso.

Confirmação da metilação do pirosequenciamento
Para confirmar os achados da matriz de 450 K, realizamos pirosequenciamento com DNA convertido em bissulfito. Selecionamos cinco sites para confirmação, priorizando sites dentro de DMRs e sites com baixo FDR. Calculamos as correlações de Spearman entre os valores de β obtidos a partir do pirossequenciamento e do arranjo de 450 K e realizamos a regressão linear para verificar a associação dos valores de β- pirosequenciamento com o abuso na infância.

Análise de mediação exploratória
Para examinar se os fatores de risco para a saúde na idade adulta podem explicar uma possível associação entre abuso infantil e DNAm, realizamos duas análises. Primeiro, examinamos se esses fatores de risco foram carregados em DNAm PCs, usando ANOVAs unidirecionais para variáveis ​​ordinais e correlações de Spearman para variáveis ​​contínuas. Em seguida, examinamos as sondas identificadas nas análises de DMR. Para cada sonda na DMR de abuso na infância, comparamos a associação do abuso infantil com DNAm em modelos lineares ajustados apenas para idade e volume de sêmen (modelo base) e em modelos ajustados para: (1) comportamentos de risco à saúde (tabagismo e IMC) ; (2) saúde mental (sintomas de estresse depressivos e pós-traumáticos); e (3) exposição ao trauma. Calculamos% mediação como: [( β abuso infantil, modelo base – βabuso infantil, modelo ajustado ) / β abuso infantil, modelo base ] * 100 para cada sonda e calculada a mediação média em todas as sondas dentro de cada DMR para cada conjunto de mediadores hipotéticos. Nós não incluímos todos os mediadores hipotéticos em um único modelo para evitar overfitting.

Sondas associadas ao abuso infantil em estudos anteriores
Examinamos a associação de 1667 sondas previamente identificadas como associadas ao abuso infantil 11 , 14 , 15 , 16 . Consideramos sondas com FDR <0,05 como estatisticamente significativas, representando vários testes dentro desse conjunto de sondagens de 1667. Disponibilidade de código O código está disponível no GitHub 60 . Resultados
Os participantes do estudo foram semelhantes a todos os participantes da GUTS (participantes, média = 25,7 anos, faixa = 23-29 anos; GUTS, média = 25,8 anos, variação = 23-31 anos) e raça / etnia (participantes, 91,2% brancos; GUTS, 93,2% brancos), e tiveram uma maior prevalência de exposição a altos níveis de abuso infantil (participantes, nenhum abuso = 35,3%, alto = 50%; GUTS, nenhum abuso = 26,3%, alto = 28,8%). As características dos participantes do estudo e amostras de sêmen foram semelhantes entre os níveis de exposição ao abuso infantil (todos p  > 0,05, Tabela 1 ).

Análise de componentes principais
O PC4 foi correlacionado com o abuso na infância (correlação de Spearman p  ≤ 0,05) e explicou 6,2% da variação no DNAm (fig. 1 ). A idade do participante também foi correlacionada com o PC4 e ajustada nas análises de DMR. Para identificar as sondas, que foram ambos fortemente associados com PC4 e foram ligados à exposição abuso infantil, que seleccionado sondas com as maiores pontuações PC4 ( N  = 8795) e, em seguida, a partir destas sondas seleccionadas com DNAM Δ p  ≥ 5% entre alta e não abuso, resultando em mais de 1000 sondas ( N  = 1137, Tabela Suplementar S2 ). Os dois homens que sofreram abuso sexual não foram outliers entre os homens que sofreram abuso (Figura Suplementar S4 ).

Análise DMRs
Foram identificados 13 DMRs que atendem aos nossos critérios: (1) FDR ≤ 0,05; (2) significa Δ β  ≥ 5%; e (3) continha ≥ 3 sondas. Destes 13 DMRs, 12 preencheram estes três critérios em análises usando amostras originais de 22 homens e replicaram amostras de 12 homens ( N  = 34). Estes 12 DMR continham 64 sondas (Tabela 2 , Figura 2 e Figura Suplementar S5 ). Três DMRs foram localizados em potenciadores, dois foram localizados em locais de início da transcrição, seis foram localizados em ilhas CpG e três foram localizados em corpos de genes (Tabela Suplementar S3 ). O ICC entre amostras replicadas ( N  = 12) para os 63 locais CpG que compõem estes 12 DMRs foi maior que 0,7 para 90% dos locais (Figura SuplementarS6 ). Os resultados foram semelhantes com abuso infantil codificado como uma variável contínua.

Os sites identificados na análise de DMR se sobrepunham consideravelmente a sites identificados na análise de PC. Trinta e cinco dos 63 locais CpG nos DMRs estavam entre os locais que mais carregavam no PC4.

Pyrosequencing
Para pyrosequencing confirmação de 450 os resultados da matriz K, foram selecionados quatro locais CpG contidos em DMRs abuso infantil: o ARL17A de fragmentação (cg04703951), o MAPT cluster (cg00438222) e o LRRK1 cluster (cg09926099 e cg00293616), e um local adicional (cg08780220) com base no seu baixo FDR. Todos os locais apresentaram correlações significativamente altas entre as medidas obtidas por 450 K e pirosequenciamento (classificação de Spearman ρ ≥ 0,74, p  ≤ 4,0 × 10 –7 , Figura Suplementar S7 ), e foram significativamente associadas ao abuso infantil em regressões lineares após correção para múltiplos testes ( Figura Suplementar S8 , Tabela Suplementar S4). O ensaio de pirosequenciação para o cg04703951 mediu adicionalmente o DNAm em quatro locais CpG não representados no arranjo de 450 K. Estes quatro locais adicionais foram altamente correlacionados com locais vizinhos medidos no arranjo de 450 K (ρ ≥ 0,88) e diferiram significativamente por abuso infantil ( p  ≤ 3,9 × 10-8 , Fig. 3 , Tabela Suplementar S4 ).

Análises de aprendizado de máquina
A abordagem de aprendizado de máquina identificou três sondas (cg02622647, cg04703951 e cg17369694) como as mais úteis para classificar os participantes como nenhuma ou média ou alta exposição a abuso. Essas sondas classificaram corretamente 71% dos participantes (12 verdadeiros positivos, cinco falsos positivos, 15 verdadeiros negativos e dois falsos negativos). Duas dessas três sondas também foram identificadas nas análises de DMR e PC (cg02622647 e cg04703951, cluster ARL17A ), mostrando a concordância desses métodos. Em três conjuntos de dados independentes, GSE108058, GSE102970 58 e GSE64096 59 , este preditor de três sondagens previu prevalência de abuso de 30%, 35% e 25%, respectivamente, semelhante aos 29% encontrados na coorte do STUI.

Análises de mediação
Nenhum dos nossos mediadores hipotéticos foi associado ao PC4, o CP que foi significativamente associado ao abuso na infância. Para sondas em DMRs de abuso infantil, a associação de abuso infantil com DNAm foi de certa forma atenuada em modelos que incluem também sintomas de estresse depressivo e pós-traumático (dois de 12 DMRs, mediação média = 11,2 e 13,6%) e em modelos que incluem exposição ao trauma ao longo da vida 12 DMRs, intervalo médio de mediação = 14,0-23,7%), mas não em modelos que incluem tabagismo e IMC (média de mediação <5,7% para todos os DMRs). A associação de abuso na infância com DNAm foi um pouco mais forte após o ajuste para a saúde mental em dois DMRs ( DLL1 e SYCE1 ) e após o ajuste para o trauma ao longo da vida em três DMRs ( MAPT , DLL1e NDFUA10 , Tabelas Suplementares S5 - S7 ). Não encontramos uma associação estatisticamente significativa de abuso infantil com qualquer uma das sondas candidatas identificadas em estudos anteriores de abuso infantil 11 , 14 , 15 , 16 . Discussão
O abuso na infância tem sido associado a alterações em múltiplos sistemas biológicos na idade adulta 9 , e vários estudos encontraram diferenças no DNAm no tecido somático por abuso infantil 16.. Examinamos se o abuso na infância estava associado ao DNAm do esperma na idade adulta e descobrimos evidências de que o DNAm do esperma varia de acordo com as experiências de abuso infantil. As três abordagens que usamos para identificar diferenças no DNAm associadas ao abuso infantil, PCA, análise DMR e aprendizado de máquina, encontraram locais sobrepostos de maneira significativa. Além disso, os ensaios de pirosequenciamento identificaram locais adicionais próximos e correlacionados com locais medidos pelo arranjo de 450 K que também foram metilados diferencialmente por abuso infantil. Juntos, esses resultados sugerem que nossos resultados refletem diferenças no DNAm associadas ao abuso.

Várias DMRs que identificamos estavam localizadas dentro de genes, embora não se saiba se esses sítios específicos estão associados à expressão do gene em espermatogônias ou, em caso afirmativo, se o Δ β encontrado por nível de abuso tem significância biológica. A clusterina (CLU) é uma chaperona molecular extracelular expressa nos tecidos cerebrais e embrionários que responde a condições de estresse e tem sido implicada em distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer e Parkinson 61 . Além disso, os transcritos de RNA da clusterina passam do esperma humano para o oócito na fertilização 62 . Acredita-se que a MAPT esteja envolvida na migração neuronal e no estabelecimento da polaridade neuronal 63 e foi implicada no neuroticismo 64.e distúrbios neurodegenerativos. O PRDM16 é um regulador transcricional envolvido na regulação de células gordurosas 65 , 66 . O SDK1 codifica uma proteína na superfamília das imunoglobulinas 63 . Assim, os DMRs foram encontrados em genes que codificam proteínas com uma variedade de funções, consistentes com os efeitos documentados do abuso infantil no cérebro, peso corporal e sistema imunológico. As DMRs encontradas não se sobrepuseram às DMRs anteriores, identificadas em um estudo de sintomas paternos de espermatozóides e descendentes do transtorno do espectro do autismo 67 nem com sondas no tecido cerebral, saliva e sangue periférico identificadas em estudos anteriores de maus-tratos infantis 11 , 14 , 15 ,16 .

Descobrimos que a maior exposição ao trauma e maior prevalência de sintomas de estresse depressivo e pós-traumático em homens que sofreram abuso infantil em comparação com os homens que não foram responsáveis ​​por algumas das associações entre abuso infantil e DNAm de esperma em cinco DMRs. O abuso na infância e outros tipos de eventos traumáticos têm efeitos biológicos comuns, por exemplo, no eixo HPA 68 , 69 e inflamação sistêmica 70 , portanto é plausível que o abuso e outros tipos de trauma também compartilhem efeitos no DNAm 71 , 72 . No entanto, a associação de abuso infantil com DNAm também foi mais forteem cinco DMRs após novos ajustes para a saúde mental e trauma ao longo da vida. Em conjunto, esses resultados de mediação também são consistentes com o acaso.

Nossas descobertas devem ser consideradas à luz de limitações importantes. Primeiro, nosso tamanho de amostra era pequeno. Portanto, nossa identificação de DMRs associados ao abuso infantil deve ser interpretada com cautela e usada principalmente como ponto de partida para futuras pesquisas. Devido ao nosso pequeno tamanho da amostra, nosso exame de seqüelas na idade adulta de abuso infantil que possam mediar uma relação entre abuso e DNAm deve ser considerado exploratório. Em segundo lugar, nossa amostra foi predominantemente branca, assim, nossos achados podem não se aplicar a homens de outras raças.

Estudos em animais indicaram que estressores psicossociais podem afetar ambos os padrões epigenéticos no fenótipo de espermatozóides e descendentes. Camundongos machos condicionados ao medo relacionado ao odor exibiram diferenças no DNAm do esperma em um locus relacionado ao receptor do odor. Esses camundongos condicionados pelo medo produziram duas gerações de descendentes com a mesma resposta de medo relacionada ao odor, bem como alterações correspondentes nas estruturas neuronais, resultados robustos para a adoção cruzada e a fertilização in vitro 24 . Camundongos expostos a estressores crônicos apresentaram maior concentração de nove RNAs micro-espermatozoides (miRNAs) e alterações do eixo HPA na prole 26 . A injeção desses nove miRNAs nos zigotos produziu uma função similar no eixo HPA, sugerindo um papel causal dos miRNAs na biologia da prole .. Em outro experimento, camundongos expostos precocemente à separação materna imprevisível tiveram padrões alterados de pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) em espermatozoides e tiveram filhos com diferenças comportamentais em comparação com a prole de controle. A injeção de RNA do espermatozóide em oócitos fertilizados reproduziu essas diferenças comportamentais 27 . Assim, experimentos robustos indicaram que os estressores podem afetar a epigenética dos espermatozóides murinos, incluindo o DNAm, e a biologia dos descendentes.

A evidência de que os estressores psicossociais afetam a epigenética do esperma humano permanece limitada. Até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a documentar uma associação de estressores psicossociais e epigenética de espermatozóides em humanos. Evidências indiretas de que estressores podem afetar epigenética esperma em humanos é sugerido por estudos que encontraram diminuição da qualidade do esperma nos homens expostos a estressores psicossociais 29 , 74 , 75 , bem como a associação de outros tipos de exposições ambientais com padrões epigenéticos esperma humano 31 , 34 , 76 , 77 , 78 .

Enquanto a maioria das marcas epigenéticas paternas de mamíferos são apagadas na fertilização e novamente durante o desenvolvimento pré-implantacional 79 , alguns loci são resistentes à desmetilação 80 , e essas marcas epigenéticas preservadas podem ser biologicamente importantes. Diversas evidências sugerem que a epigenética do esperma humano influencia tanto a fertilidade quanto a embriogênese: (1) as células espermáticas são transcricionalmente silenciosas, mas possuem marcas epigenéticas características da transcrição 81 , 82 ; (2) a cromatina dos espermatozóides apresenta padrões de modificações histonas nos locos relacionados ao desenvolvimento embrionário 81 , 82 ; (3) o mRNA de espermatozoides, produzido antes da parada transcricional, é transferido para o oócito 62; e (4) marcas epigenéticas de espermatozóides estão associadas à fertilidade 82 .

O abuso na infância precede muito o período de tempo em que os espermatozóides ejaculados estavam se dividindo e amadurecendo, portanto, não poderiam afetar diretamente o DNAm do esperma nesta fase. Em vez disso, as exposições na infância podem afetar o epigenoma das espermatogônias, que então são propagadas durante a espermatogênese na vida adulta 35 , 83 . Além disso, nossos resultados sugerem que o abuso na infância pode levar a exposições na vida adulta que afetam o epigenoma do esperma durante a espermatogênese 23 . Independentemente da sua origem, é tentador especular que essas marcas de DNAm são de alguma forma propagadas para a prole. No entanto, a pesquisa em biologia do desenvolvimento humano ainda não forneceu fortes evidências para essa possibilidade .. Além disso, notamos que a prole herda o material de um único espermatozóide, para o qual cada sítio CpG é metilado ou não metilado. Se as diferenças no DNAm associadas ao abuso infantil tornam os espermatozóides afetados menos propensos a fertilizar um óvulo, então o impacto potencial dessas mudanças sobre os descendentes também seria reduzido. Estudos em humanos documentaram resultados adversos do desenvolvimento neurológico na prole de pessoas expostas a estressores psicossociais graves, em particular, a abuso infantil 38 , 84 , 85 , 86 , 87 , 88 , 89 , 90 , 91.. A hipótese de que a experiência de estresse pode afetar a prole através do epigenoma parental foi levantada como um mecanismo potencial para essas associações 92 , 93 . Embora essa possibilidade seja intrigante, evidências moleculares de células germinativas humanas permanecem esparsas. Nossos resultados recomendam uma análise mais aprofundada desta hipótese promissora.

Informação adicional
Nota da editora: A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Direitos e permissões
Creative Commons BY
Acesso Aberto Este artigo está licenciado sob uma Licença Internacional Creative Commons Atribuição 4.0, que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer mídia ou formato, contanto que você dê crédito apropriado ao (s) autor (es) original (is) e à fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações. As imagens ou outros materiais de terceiros neste artigo estão incluídos na licença Creative Commons do artigo, a menos que indicado de outra forma em uma linha de crédito para o material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e o uso pretendido não for permitido por regulamentações estatutárias ou exceder o uso permitido, você deverá obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais. Para ver uma cópia desta licença, visitehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ .